3.5 高效液相色谱测定
3.5.1 HPLC 参考条件
a) 色谱柱：C8柱，250 mm×4.6 mm（i.d.），5 μm，或相当者；
C18柱，250 mm×4.6 mm（i.d.），5 μm，或相当者。
b) 流动相：C8柱，离子对试剂缓冲液（3.2.10）-乙腈（85+15，体积比），混匀。
C18柱，离子对试剂缓冲液（3.2.10）-乙腈（90+10，体积比），混匀。
c) 流速：1.0 mL/min。
d) 柱温：40℃。
GB/T 22388—2008
e) 波长：240 nm。
f) 进样量：20 μL。
3.5.2 标准曲线的绘制
用流动相将三聚氰胺标准储备液逐级稀释得到的浓度为0.8、2、20、40、80 μg/mL 的标准工作液，浓度由低到高进样检测，以峰面积-浓度作图，得到标准曲线回归方程。基质匹配加标三聚氰胺的样品HPLC 色谱图参见附录A 中的图A.1。
3.5.3 定量测定
待测样液中三聚氰胺的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应稀释后再进样分析。
3.5.4 结果计算
试样中三聚氰胺的含量由色谱数据处理软件或按式（1）计算获得：
A × c × V×1000
X= × f ……………………（1）
As × m×1000
式中：
X —— 试样中三聚氰胺的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；
A —— 样液中三聚氰胺的峰面积；
c —— 标准溶液中三聚氰胺的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；
V —— 样液最终定容体积，单位为毫升（mL）；
As —— 标准溶液中三聚氰胺的峰面积；
m —— 试样的质量，单位为克（g）；
f —— 稀释倍数。
3.6 空白实验
除不称取样品外，均按上述测定条件和步骤进行。
3.7 方法定量限
本方法的定量限为2 mg/kg。
3.8 回收率
在添加浓度2 mg/kg～10 mg/kg浓度范围内，回收率在80%～110%之间，相对标准偏差小于10%。
3.9 允许差
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
4 第二法液相色谱-质谱/质谱法（LC-MS/MS）
4.1 原理
试样用三氯乙酸溶液提取，经阳离子交换固相萃取柱净化后，用液相色谱-质谱/质谱法测定和确证，外标法定量。
GB/T 22388—2008
4.2 试剂与材料
除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。
4.2.1 乙酸。
4.2.2 乙酸铵。
4.2.3 乙酸铵溶液（10 mmol/L）：准确称取0.772 g 乙酸铵于1 L 容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，
混匀后备用。
4.2.4 其他同3.2。
4.3 仪器和设备
4.3.1 液相色谱-质谱/质谱（LC-MS/MS）仪：配有电喷雾离子源（ESI）。
4.3.2 其他同3.3。
4.4 样品处理
4.4.1 提取
4.4.1.1 液态奶、奶粉、酸奶、冰淇淋和奶糖等
称取1 g（精确至0.01 g）试样于50 mL具塞塑料离心管中，加入8 mL三氯乙酸溶液（3.2.8）和2 mL乙腈，超声提取10 min，再振荡提取10 min后，以不低于4000 r/min离心10 min。上清液经三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤后，做待净化液。
4.4.1.2 奶酪、奶油和巧克力等
称取1 g（精确至0.01 g）试样于研钵中，加入适量海砂（试样质量的4倍～6倍）研磨成干粉状，转移至50 mL具塞塑料离心管中，加入8 mL三氯乙酸溶液（3.2.8）分数次清洗研钵，清洗液转入离心管中，再加入2mL乙腈，余下操作同4.4.1.1中“超声提取10 min，……做待净化液”。
注：若样品中脂肪含量较高，可以用三氯乙酸溶液饱和的正己烷液-液分配除脂后再用SPE柱净化。
4.4.2 净化
将4.4.1中的待净化液转移至固相萃取柱（3.2.13）中。依次用3 mL水和3 mL甲醇洗涤，抽至近干后，用6 mL氨化甲醇溶液（3.2.9）洗脱。整个固相萃取过程流速不超过1 mL/min。洗脱液于50℃下用氮气吹干，残留物（相当于1 g试样）用1 mL流动相定容，涡旋混合1 min，过微孔滤膜（3.2.16）后，供LC-MS/MS测定。
4.5 液相色谱-质谱/质谱测定
4.5.1 LC 参考条件
a) 色谱柱：强阳离子交换与反相C18混合填料，混合比例（1：4），150 mm×2.0 mm（i.d.），5 μm，或相当者。
b) 流动相：等体积的乙酸铵溶液（4.2.3）和乙腈充分混合，用乙酸调节至pH=3.0后备用。
c) 进样量：10 μL。
d) 柱温：40℃。
e) 流速：0.2 mL/min。
4.5.2 MS/MS 参考条件
a) 电离方式：电喷雾电离，正离子。
b) 离子喷雾电压：4 kV。
c) 雾化气：氮气，40 psi。
d) 干燥气：氮气，流速10 L/min，温度350℃。
e) 碰撞气：氮气。
f) 分辨率：Q1（单位）Q3（单位）。
g) 扫描模式：多反应监测（MRM），母离子m/z 127，定量子离子m/z 85，定性子离子m/z 68。
h) 停留时间：0.3 s。
i) 裂解电压：100 V。
j) 碰撞能量：m/z 127>85 为20 V，m/z 127>68 为35 V。
4.5.3 标准曲线的绘制
取空白样品按照4.4 处理。用所得的样品溶液将三聚氰胺标准储备液（3.2.12）逐级稀释得到的浓度为0.01、0.05、0.1、0.2、0.5 μg/mL 的标准工作液，浓度由低到高进样检测，以定量子离子峰面积-浓度作图，得到标准曲线回归方程。基质匹配加标三聚氰胺的样品LC-MS/MS 多反应监测质量色谱图参见附录A 中的图A.2。
4.5.4 定量测定
待测样液中三聚氰胺的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应稀释后再进样分析。
4.5.5 定性判定
按照上述条件测定试样和标准工作溶液，如果试样中的质量色谱峰保留时间与标准工作溶液一
致（变化范围在±2.5%之内）；样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表1的规定，则可判断样品中存在三聚氰胺。
表1 定性离子相对丰度的最大允许偏差
相对离子丰度>50% >20%至50% >10%至20% ≤10%
允许的相对偏差±20% ±25% ±30% ±50%
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