- 政策解读
- 经济发展
- 社会发展
- 减贫救灾
- 法治中国
- 天下人物
- 发展报告
- 项目中心
[养殖技术]胚胎移植技术
关键词： 超排 回收液 胚胎质量 低温生物学 形态学检查 1986年 Polge 触诊法 PMSG 塑料套管
|
|
牛胚胎移植的主要技术环节有供、受体母牛的选择，供体母牛的超数排卵处理，受体与供体牛的同期发情，胚胎的回收，胚胎质量的鉴别，胚胎移植等。
一、超数排卵
牛的卵巢含有几十万个卵母细胞（Erickson , 1966），由于母牛受孕次数受到妊娠期长短的限制，所以，母牛一生的产犊数很有限。为此对作为供体用的母牛进行超数排卵处理，通过使其临时性妊娠，取出妊娠的早期胚胎，再移植给生理条件相同的另一头受体母牛生殖道内，继续完成妊娠，可大大增加供体母牛的后代。
1.影响超数排卵效果的主要因素
超数排卵是胚胎移植的一个关键技术环节，受多种因素影响，个体反应差异很大。据郭志勤等（1992）对荷斯坦奶牛作供体的研究结果有以下主要因素：(1)超排激素；(2)卵巢状态；(3)季节；(4)胎次；(5)产奶量；(6)发情周期天数；(7)产后间隔天数；(8)排卵数；(9)重复超排。
2.供体和受体牛的准备
供体牛选择的首要条件是其遗传学价值及其健康和繁殖情况，所以，确定供体前需作必要的检查，经确定后要加强饲养管理，观察发情，确定正确的发情周期。每头供体牛需要准备5 头受体牛，两者的发情开始时间前后相差不超过一天。
在一般情况下，不易找出若干头自然发情与供体牛发情时间相同的受体牛，所以在胚胎移植时往往采用对供体与受体牛进行同期发情处理。同时对供体牛进行超数排卵处理。
3.超数排卵方法
超数排卵（超排）的目的是为了增加有活力卵子的数量。通常在供体牛发情周期的功能性黄体期，一般在母牛发情周期的9-14天，肌肉注射PMSG或FSH ，以刺激卵巢产生额外的卵泡。待处理后供体牛再次发情时静脉注射LH或HCG，以诱导卵泡排卵。但对成年母牛一般不需要外源LH或HCG。
近年来，由于前列腺素刀。及其类似物如前列烯醇在超排方法上的应用，增加了超排处理的机动性，可在供体母牛发情周期的功能性黄体期的任何一天处理，而且增加了可用胚胎的比例。母牛在PG注射后的2-3天大多出现发情。
对超排处理的供体牛输精需2-3次，间隔12h，每次的输精量要大于正常的输精量，应保证有足够的有效精子。
4.重复超排
重复超排一般对采用非手术回收卵的牛较为实用。据作者的研究，供体母牛一年超排四次，每次间隔2-3个月，对超排效果无明显影响。重复超排的次数多，间隔短，易使供体产生对促性腺激素抗体，影响处理效果。当然使用同种动物的促性腺激素可以减少抗体的作用。
（二）卵子的回收
根据家畜的种类以及采卵时卵子在母体生殖道的部位，可主要分手术和非手术采卵两种方法。
1.器材与试剂
(1)外科手术器械手术刀、止血钳、肠钳、缝合针、线、电动剪毛剪、保定架、冲卵管、接卵杯等。
(2)牛用非手术冲卵器械牛用非手术回收卵的器械多采用日本FHK（富士平株式会社）生产的产品。
2.常规手术法采卵
母畜发情后卵子在输卵管内停留3-4天，然后向子宫移动。所以对发情后1-3天的供体畜一般从输卵管采卵，为此需要采用手术方法。采集输卵管内的卵子可从伞部向子宫角方向冲洗或由子宫向伞部冲洗两种方法。由于母猪和马的子宫一输卵管连接部的阀门样结构，因而冲洗时应采用由伞部向子宫方向冲洗。其他各种动物均可采用反向冲洗。母畜在发情5天后通常卵子离开输卵管进人子宫，此时，可对子宫角冲洗，但较多发生子宫黏连现象。
3.非手术采卵
非手术采卵有很多优点，不仅减少了手术对供体的危害，节约时间，降低成本，而且便于重复采卵。多年来，很多学者在供体母牛通过子宫颈回收胚胎上作了不少研究，但采集效果不稳定。Sugie 等（1972）使用一种二通或三通管构成的器械，用2000-3000ml冲卵液从45/60超排母牛中，平均采集到6.2枚卵（范围1-18）。1976年Brand、drost 和Aarts使用一种改进的Sugie装置，冲洗未经超排处理的母牛获得11.5%采卵率，还从4/5头超排母牛中采得12/13个胚胎，非手术法经过广泛研究改进后得到发展。
近年来，大多采用凡Folley氏导管或Stewart三通导管以及相似的器械。铃木达行1986年介绍的改进的多孔式冲卵管。经试验这种改进后的冲卵管可提高胚胎的回收率。
1985年日本FHK （富士平株式会社）生产的封闭式半自动冲卵器，它的优点是冲卵液和回收液一直保持在恒温的水浴锅中，适于冬季操作。冲卵液是用气泵对冲卵液瓶加压，经冲卵管进人子宫，通过" Y”管回收到集卵瓶中，冲洗次数和每次冲洗的冲卵液量由电门开关控制。
非手术回收牛胚胎通常用带金属芯的冲卵管插人一侧子宫角，给气囊充气，固定冲卵管，抽出金属芯，先灌人30-50ml冲卵液，观察回流情况。同时隔着直肠对子宫角轻轻按摩。这样反复多次直至用完300-500ml冲卵液为止。此时借直肠把握将金属内芯插人冲卵管放气，并把冲卵管从冲卵侧子宫角抽出，通过子宫体转向插人另一侧子宫角，重复以上操作，这样可减少污染。对青年母牛可先用子宫颈扩张棒扩张子宫颈。此外，为了减少冲卵管插人子宫时将子宫颈内的黏液推人子宫，日本用一种黏液除去器先将子宫颈的黏液吸除，同时也起到先疏通子宫颈的作用。
（三）检卯技术
检卵技术主要是从回收液中，将受精卵或胚胎捡出，并进行必要净化处理，然后对捡得的胚胎进行形态学鉴定来确定其品质。在对胚胎的质量鉴定时，应考虑到胚胎的日龄，结合它的发育状态，判断优劣，然后确定胚胎的用途，移植或保存。
1 ．检卵前的准备
(1)短期培养液的配制 PBS用0.22um的细菌过滤器过滤，再用经56℃ 水浴30min灭活的犊牛血清或供体母畜的同种发情母畜血清，经0.45um细菌过滤器过滤后，配制成10％血清的PBSS液。按200ul的液滴，每皿4-6滴，分别装人数个塑料小皿并编号。为了防止蒸发，需将装有PBSS的小皿放人1个加有浸湿棉球的大玻璃平皿中，置于室温备用。
(2)回收液的处理由于供体母牛采用非手术冲卵有大量的回收液，不便捡卵，为此需根据不同集卵器具，采用相应的方法。静置法：适用于用大器皿收集回收液，需在室温静置30min，然后用一个聚乙烯软管插人回收液的中下层，将上层回收液虹吸至另一个器具，留下底层100ml左右，轻轻摇晃几下，使浮在表面的卵下沉，再分别倒人表玻璃皿镜检。
漏斗法:用漏斗接收回收液。可将最后留在斗中的回收液倒人玻璃皿中，再放人适量PBS冲洗漏斗后回收作镜检。
漏网式集卵杯:用20G针头的注射器吸20mlPBS冲洗集卵杯内侧的尼龙网，稍时静止，吸去上层泡沫即可。
2.检卵与卵的净化
从回收液中捡卵可用实体显微镜放大16倍。根据器具的形态从上到下、从左至右或从外到里螺旋形依此移动，将找到的卵用吸管吸出放人装有PBSS保存液的小皿中，然后进行卵的净化和质量的鉴别。
从输卵管或子宫内回收的冲卵液，常含有大量生殖道分泌物和脱落的上皮细胞，甚至还可能有污染的微生物或子宫内感染的病原，所以，捡回的卵需要净化。净化处理是将捡出的卵移人已备好的小皿的PBSS液滴中，然后按顺序，依次轻轻吸卵、清洗，可先吸些PBSS吹向卵的周围，使卵在液滴中翻腾，清除卵周围的黏连物。
3.胚胎质量鉴定
(1)胚胎的发育将净化后的卵子置于新鲜的PBSS液中，放大40-200倍作形态学检查。卵子受精后随着日龄的增加，处于不同的发育阶段，所以胚胎的质量评定，要考虑到胚龄。通常以母畜发情日为0天来计算，距发情日的天数即为胚龄。胚胎的正常发育阶段应与胚龄相一致，凡胚胎的形态鉴别认为迟于正常发育阶段一天的，一般质量欠佳。
(2)胚胎的分级
A.优良胚胎：形态典型，卵细胞和分裂球的轮廓清晰，细胞质致密，色调和分布极均一。
B.普通胚胎：与典型的胚胎相比，稍有变形，但卵细胞和分裂球的轮廓清晰，细胞质较致密，分布均匀，变性细胞和水泡不超过10-30％。
C.不良胚胎：形态有明显变异，卵细胞和分裂球轮廓稍不清晰，或部分不清晰，细胞质不致密，分布不均匀，色调发暗，突出的细胞、水泡和变性细胞占30％-50％。
凡总体形态结构不正常的卵子，未受精的、退化的或破碎的卵子，透明带空的或快空的卵子，以及与正常胚龄相比，发育迟2天或2天以上的胚胎均难以继续正常发育，都应弃去。
（四）胚胎的移植
胚胎的移植是整个胚胎移植技术的关键一环。经过形态结构、发育状况和品质综合鉴别的胚胎，可直接移植给受体母畜或进一步作体外保存。胚胎移植的成功率除胚胎质量外，还受操作技术、受体畜的选择、饲养管理等因素的影响。
1.受体母畜的选择与管理
受体母畜一般选用遗传品质较差的土种或低代杂种。要求体格较大，膘度适中，无疾病的健康母畜，并有正常的发情周期，生殖道无疾患。青年牛需16-18月龄，成母牛2-3岁，羊以经产母羊较好。移植前要正确地观察发情，作好记录，打上标记。受体母畜发情天数与供体母畜前后不超过1天。受体群的饲养管理应和供体群同样对待，给予清洁的饮水和足够的草料，保持中等营养水平。对手术和已确定妊娠的母畜可适当增加日粮，以保证伤口的全愈和满足妊娠的需要，防止流产。
2.手术移植
绵、山羊、猪等小家畜的胚胎移植一般均采用外科手术方法。通常用全身麻醉或局部麻醉，从股中线切口剖腹，取出子宫和输卵管、卵巢，观察黄体发育情况。根据胚胎的发育情况，分别移入输卵管或直接移入子宫角。
一般少于8-细胞的受精卵应移入输卵管。因为早期受精卵在子宫内易受到子宫分泌物的伤害。多于8-细胞的受精卵应移人子宫角。猪和兔例外，4-细胞后期的猪受精卵应移入子宫；16-细胞的兔受精卵应移入输卵管。移卵管有玻璃细管、塑料管及带塑料套管的针管等，接1ml卡介苗注射器，吸人新鲜PBSS三小段，中段含胚胎。将8-细胞以下的受精卵经伞部插人输卵管2-3cm ，注人胚胎。子宫角移植，前后差异不大，先用钝针将子宫角开洞，再插人移卵管，并确认在子宫角腔内，注入胚胎。抽出移卵管时要慢，防止将胚胎带出。
3.非手术移植
自1972年Sugie等使用一种两个或三个通道构成的器械以来，牛的非手术取卵有很大发展，器械也有多方面的改进。到1976年以后牛的非手术取卵和移卵被广泛采用。
(1)器械目前多采用不锈钢或塑套管移植器，一般由外套、移植管及内芯组成。使用前需高压消毒。
(2)受体牛的准备根据发情记录，确定与供体母牛同期的受体母牛。移植前用1.5-2ml(2%)利多卡因硬膜外鞘麻醉，或用镇静剂静松灵；并做直肠检查，确认排卵侧和黄体发育情况，发情6-8天的母牛，一般黄体基部直径应大于1.5cm，移植前对外阴部彻底消毒。
(3)胚胎的准备用0.25mm的塑料细管，分三段吸人新鲜PBSS，胚胎在中段。根据受体牛的发情天数选择胚胎的发育阶段，一般将致密桑根胚、早期囊胚和囊胚，分别移给发情6天、7天和8天的受体母牛。
(4)移植操作扒开阴唇，插人全套移植器，至子宫颈外口，另一只手插入直肠找到子宫颈，移卵管顶开外套，进人子宫颈。缓慢地将移卵管送至子宫角大弯或大弯深处，在移卵管前端留下富余的间隔，并用在直肠内的手托起子宫角内的移卵管，使其处于宫角部，慢慢推入钢芯，然后缓慢地抽出移卵管。
（五）妊娠诊断
胚胎移植后，为了早期确定受体母牛的妊娠情况，便于加强饲养管理和确定受胎情况。一般对移植后不返情的母牛，作妊娠诊断。
1.乳汁孕酮测定法
利用放射免疫方法测定奶中孕酮含量作早期妊娠诊断是近十几年发展起来的一项新技术。1971年英国的laing 及Heap应用竞争蛋白结合方法测定乳汁孕酮进行早期妊娠诊断，首先在奶牛上获得成功；l973年Heap又将竞争蛋白结合法改为放射免疫分析法。Hoffmann等为排除乳脂率对测定结果的影响，1976年建立了乳脂孕酮的测定方法，1979年Claus等又改进和简化了乳脂孕酮的测定程序。目前，国外一些养牛业发达的国家，已将这种方法应用于奶牛的繁殖管理。
寻求简便而准确的早期妊娠诊断方法，一直是畜牧业生产中急待解决的问题。测定奶中孕酮作奶牛和山羊的早期妊娠诊断的研究工作，在我国已经有中国农科院畜牧所（1982年），西北农学院（1981年）等单位作了报道。
2.直肠检查法
在简易准确的早期妊娠诊断方法上，迄今为止大家畜仍以直肠触诊法最为经济可靠。但一般需要专门的技术培训，要有一个熟练过程。有效诊断时间是青年母牛为5周，成年母牛为6周，触摸5周的子宫，子宫角沟仍较清楚，孕角及子宫体变粗、柔软、壁薄，触诊一般不收缩。用拇指及食指轻轻捏起子宫角，然后稍微放松，可感觉到子宫内先有一薄膜滑开这是尚未附植的胚囊壁。此时在角间韧带前方可摸到豆行的羊膜囊，据测定妊娠28天羊膜囊直径为2cm，35天3cm,40天以前为球形。
怀孕60天的牛孕角比空角粗两倍，两角差异明显，孕角有波动，角间沟稍微平坦，但仍能分辨，可摸到整个子宫。直肠检查一般均需进行90天复查，定胎。
3.“B”超诊断法
超声波诊断是上世纪40年代发展起来的新兴技术。Wegale ( 1956)首先在兽医上应用。近年来这项技术发展很快，是快速、准确和早期妊娠诊断的最理想方法。一般牛在配种后21天，绵、山羊30-50天，马9天，即可作出准确判断。但设备昂贵，不易推广。
（六）胚胎保存
从广义上讲，胚胎保存就是设法将离开母体的胚胎在体外或异体母畜体内暂时保存的一种方法。体外保存又分短期低温（10℃-O℃）和长期冷冻保存（-196℃）。低温保存时间不能太长，主要原因是过于低温条件下，细胞内成分特别是酶不稳定。但其优点是不需要经受冻-融的复杂过程。而长期的冷冻保存是指在液氮（-196℃）中的保存。自1949年Polge冷冻哺乳动物精子获得成功，发现了甘油在精子冷冻过程中能起到保护作用。这标志着近代低温生物学的开端。此后，低温生物学广泛应用于医学、生物学和畜牧业中。1972年英国学者Whittingham 首先成功地冷冻保存了小鼠胚胎。1973年Wilmut和Rouso以甘油为防冻剂保存牛胚胎获得成功。随后相继在羊、家兔、马、大鼠、人、狒、猴等冷冻胚胎保存成功。
胚胎冷冻保存是使胚胎移植技术真正走向商业化生产的关键因素。胚胎的冷冻保存可以使胚胎移植能在任何时间、任何地点进行，还可以利用这项技术建立良种家畜和濒危动物的胚胎库；并可防止由于疾病或其他原因造成的各种动物品系和稀有突变体的丢失；而且可以进行快速、廉价的国内外胚胎运输，简化了引种过程；使家畜的遗传资源在世界范围内的转移成为可能。
（据农业部网站消息）