基因编辑技术：进展与挑战
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CRISPR/Cas9 衍生技术
随着 CRISPR/Cas 系统的研究不断深入，Cas9 核酸酶的催化机制也被揭示，并且可以通过特定位点氨基酸的突变获得单链靶向剪切功能的 Cas9 切刻酶（Cas9 nickase，Cas9n）或者全失活的 Cas9（dead Cas9，dCas9），而这些不同的 Cas9 核酸酶，衍生出了适用范围更为广泛的基因编辑系统。
CRISPR/Cas9-nickase 基因编辑技术。CRISPR/Cas9 系统使用的 crRNA 能容受一定程度的错配导致脱靶效应的产生，限制了 CRISPR/Cas9 系统在高精度编辑中的应用。为了提高 Cas9 编辑系统的精度，Ran 等巧妙利用 Cas9 D10A 突变体具备切刻酶活性的特性，设计了“一个位点，双 sgRNA 靶向”的策略，即 CRISPR/Cas9-nickase 基因编辑技术（图 2a）。其原理与 ZFN 和 TALEN 类似，两个 Cas9n/sgRNA 复合物同时靶向一个位点，分别切割其中一条 DNA 链，实现双链断裂，诱导 NHEJ 或者 HR 修复。使用这种策略，细胞系中基因编辑的脱靶效率最高可以降低近 4 个数量级。
CRISPR/dCas9-FoKI基因编辑技术。同样是为了解决 CRISPR/Cas9 技术的脱靶问题，Guilinger 等采用了基于 dCas9 的策略。理论上 dCas9/sgRNA 只能起到单纯的靶向引导作用，无法诱导 DNA 的断裂，类似于 ZFN 或者 TALEN 中的 DNA 结合结构域。为了实现 DNA 的切割，其引入的 FoKI 核酸内切酶的切割结构域（图 2b），与 dCas9 连接做成融合蛋白 fCas9，这与 ZFN 及 TALEN 的设计策略如出一辙。在人类细胞的基因编辑中，fCas9 的特异性比野生型 Cas9 要高出 140 倍以上。而在高度类似的脱靶位点上，fCas9 的特异性要比 Cas9n 至少高出 4 倍。fCas9 的应用将进一步丰富 Cas9 工具箱，提供更完善的基因编辑工具。