基因编辑技术：进展与挑战
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TALENs 技术
ZFN 技术将基因编辑引领进了不再单纯依赖自然发生 DSBs 的时代，但其存在很大的局限性，如成本高、难以实现多靶点编辑等。而 TALE（transcription activator like effector）基序的发现催生了第二代基因编辑技术——TALENs（TALE nucleases）。TALEN 的构造与 ZFN 类似，由 TALE 基序串联成决定靶向性的 DNA 识别模块，与 FokI 结构域连接而成。与 ZF 基序不同，一个 TALE 基序识别一个碱基对（图 1b），因此串联的 TALE 基序与所识别的碱基对是一一对应的关系。研究发现，对于相同的靶点 TALENs 有与 ZFNs 相同的切割效率，但是毒性通常比 ZFNs 的低，另外其构建也比 ZFNs 容易。然而，TALENs 在尺寸上要比 ZFNs 大得多，而且有更多的重复序列，其编码基因在大肠杆菌中组装更加困难。
RNA引导的基因编辑技术
CRISPR/Cas9 技术
CRISPR/Cas 系统原本是细菌和古菌进化出来用于抵御外来病毒及质粒 DNA 的适应性免疫系统。II 型CRISPR/Cas 系统依赖于外源 DNA 片段在规律成簇的短间隔回文重复（clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR）位点整合，其经过转录及剪切后产生短的 CRISPR RNAs（crRNAs），crRNA 与反式转录的 crRNA（trans-activating crRNA，tracrRNA）退火结合，然后引导 Cas9（CRISPR associated protein 9，Cas9）蛋白介导序列特异性的外源 DNA 降解。Jinek 等发现 Cas9 发挥靶向切割作用所依赖的 crRNA 和 tracrRNA 可以融合为一体，作为 sgRNA（single guide RNA）（图 1c）。随后，若干研究组陆续报道 CRISPR/Cas9 系统可用于人类细胞的靶向基因编辑。与 ZFNs 和 TALENs 技术相比，CRISPR/Cas9 的设计要简单得多，而且成本很低，对于相同的靶点，CRISPR/Cas9 有相当甚至更好的靶向效率。