人粒细胞无形体病实验室检测方案(试行)全文

2010年09月09日11:47 | 中国发展门户网 www.chinagate.cn | 给编辑写信字号：T|T

关键词：杀虫剂蜱虫综合征中毒事件疫情血小板减少疑似病例发热形体重灾区病原体

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（三）嗜粒细胞无形体核酸PCR检测。

目前，国际推荐使用16S rRNA基因检测方法，有条件的实验室，可进一步选用热休克蛋白基因groEL扩增方法。

1. DNA提取

用急性期、未使用抗生素的EDTA抗凝血或非抗凝血血球部分、白细胞及蜱研磨液提取DNA。最后，以AE缓冲液50µl抽滤以提高回收的DNA浓度。如采用血液白细胞层提取DNA，可明显提高阳性检出率。实验时，应采集当地正常人血液同时提取DNA，作为PCR的阴性对照。

2. PCR扩增

（1）16S rRNA基因检测：16S rRNA 高度保守，是PCR检测最常用的扩增靶基因，巢式PCR检测可提高检测灵敏度和特异度，采用属特异及种特异引物同时进行检测。PCR检测应分区进行，避免污染。使用引物序列见表1。

表1 巢式PCR检测无形体及埃立克体16S rRNA基因常用引物

引物名称	序列	片段长度(bp)
Eh-out1(AF414399)	5’-TTG AGA GTT TGA TCC TGG CTC AGA ACG-3’	653
Eh-out2(AF414399)	5’-CAC CTC TAC ACT AGG AAT TCC GCT ATC-3’	653
Eh-gs1(AF414399)	5’-GTA ATA CT GTA TAA TCC CTG-3’	282
Eh-gs2(AF414399)	5’-GTA CCG TCA TTA TCT TCC CTA-3’	282
HGA1	5’-GTC GAA CGG ATT ATT CTT TAT AGC TTG-3’	389
HGA2	5’-TAT AGG TAC CGT CAT TAT CTT CCC TAC-3’	389

PCR反应混合物的准备按常规进行。第一轮反应采用外引物对Eh-out1和Eh-out2，DNA模板10µl（白细胞提取的DNA可适当减少）。PCR反应体系总体积为25µl或50µl（需要进行PCR测序或克隆时，应适当扩大反应体系），其它成分的浓度按常规进行。反应程序如下：

94℃ 5min

40循环：94℃ 45sec

55℃ 50sec

72℃ 1min

72℃ 总延伸 5min

第二轮反应使用2对引物分别进行巢式PCR。2对引物分别是无形体属及埃立克体属通用内引物（Eh-gs1、Eh-gs2）；以及HGA种特异性引物（HGA1及HGA2）。检测样本取第一轮产物1-2µl为模板，阳性对照取0.5µl为模板。反应程序同第一轮反应。

（2）热休克蛋白基因groEL扩增

与groEL基因的应用相比，16S rRNA基因的应用更为广泛，但groEL基因在不同种属间具有较大的变异性。因此，对于诊断及菌株的鉴定，groEL基因均具有重要意义。该基因扩增使用巢式PCR，引物序列见表2。

表2 groEL基因扩增常用引物

DNA提取同上。PCR检测时，反应混合物的准备按常规进行。DNA模板量同16S rRNA基因检测。巢式PCR第一轮反应采用外引物对HS1及HS6。

反应程序如下：

3循环：94℃ 1min

48℃ 2min

70℃ 90sec

37循环：88℃ 1min

52℃ 2min

70℃ 90sec

68℃ 总延伸 5min

第二轮PCR引物采用HS43及HS45。检测样本取第一轮产物1-2µl为模板，阳性对照取0.5µl为模板。反应程序同第一轮反应。反应程序同第一轮反应，但退火温度由52℃改为55℃。

3．测序及分析

对扩增产物进行测序并进行同源比较，分析当地流行株与其它地区的变异性。

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