面向生物合成的代谢工程策略设计
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提高产品得率：从有到优
在赋予了细胞新的合成能力，实现了从无到有的改造之后，代谢工程的下一个目标就是以最小的原料消耗生产最多的产品。消耗单位原料（底物）可以生成的产物的量常用“得率”来表征，其是反映原料成本的一个重要指标，尤其对大宗化学品来说原料成本是影响产品生产成本的最主要因素。对某些通过简单途径就可以合成得到的产品，如乙醇、乳酸等，通过直观观察就可以得到得率最大化的代谢途径；但对大部分代谢产物，如核苷酸、芳香族氨基酸等，由于其合成途径复杂，涉及副产物及多个前体，很难通过简单观察或手工计算得到其理论得率。此外，在产品合成过程中还涉及能量（ATP）和还原力的产生和消耗，需要额外消耗底物产生能量和还原力，或通过某种途径消耗掉多余的能量还原力，这使得产物得率的计算更为复杂。基于代谢网络模型，人们提出了通量平衡分析（Flux Balance Analysis，FBA）的计算分析方法，以准确计算该网络中产物的理论得率及能达到该理论得率的最优转化途径。FBA 基于代谢网络模型中的生化反应计量关系（可以理解为一个反应中各种反应物和产物的摩尔比）和反应的不可逆性约束，通过求解约束最优化问题，得到使产物生成最大化并且满足物料和能量平衡的产品合成最优途径。由于求得的途径是通过对整体网络计算分析得到的，比由生化知识得出的常规合成途径更为全面，该方法能考虑能量平衡、辅因子平衡、多前体的平衡以及合成途径中副产物的再回收利用。该方法可以获得实现同样最大得率的多种不同策略，可能超越我们对生物化学知识的理解，得到与已知传统代谢途径不同的新途径，从而提供全新的改造靶点和策略。例如，很多生物产品都是以乙酰辅酶 A 为前体合成得到，但以葡萄糖为底物时，乙酰辅酶 A 一般由糖酵解终产物丙酮酸脱羧生成，这导致葡萄糖中的 2 个碳原子都以 CO2形式损失掉而不能进入产物，1 个葡萄糖（含 6 个碳原子）最多得到 2 个乙酰辅酶 A（共 4 个碳原子）。因此，即使全部乙酰辅酶 A 中的碳都转化到产品中，产物的最大碳摩尔得率也只能达到 0.67（图 1a）。而以大肠杆菌代谢网络模型 iJO1366 通过 FBA 对乙酰辅酶 A 衍生产品聚 3- 羟基丁酸酯（P3HB）最优得率计算结果却可达到 0.86，这表明在其代谢网络存在一些新途径可以减少碳损失。求得的最优途径中的通量分布如图 1b 所示，可见在该途径中除了常规葡萄糖经过 EMP 途径生成丙酮酸进而生成乙酰辅酶 A 途径外，还有一条称之为苏氨酸循环的途径回收甲酸和 CO2，由磷酸烯醇式丙酮酸再回到丙酮酸同时生成一个乙酰辅酶 A 用于产品合成，从而提高了产品得率。基于该途径计算结果，Lin 等在大肠杆菌中通过解调控等激活了该循环途径，将 P3HB 得率提高了将近一倍。