符合工程化需求的生物元件设计

底物选择性重设计

酶催化中心的精确空间结构赋予其高度的底物特异性等特点。面对纷繁庞杂的底物谱，从自然界中筛选新酶开发的速度远不能满足当今合成生物学需求，因此改变酶的底物特异性是计算蛋白质设计中应用最广泛的方向之一。

2015 年，Baker 课题组通过计算设计聚甲醛酶，将单碳甲醛分子固定至三碳单元的二羟基丙酮中，从而实现核心代谢步骤，首次通过催化元件设计指导新型代谢通路合成。他们以苯甲醛裂解酶（benzaldehyde lyase，BAL）为起点，利用 RosettaDesign 以及 Foldit 重新设计 BAL 的苯甲醛结合口袋以增加其对甲醛的特异性，获得 7 个突变氨基酸组成的聚甲醛酶（Formolase，FLS）。该酶对聚甲醛反应的催化效率与原始 BAL 相比增加 100 倍。在甲酸转化为二羟丙酮磷酸盐途径中，由甲酸直接还原为甲醛难度很大。为实现甲酸转化，Baker课题组先将甲酸活化为甲酰基 -CoA，降低热力学障碍。随后通过 BRENDA 数据库搜索挖掘能够将甲酰基 -CoA 还原为甲醛的酰化醛脱氢酶，并将乙酰辅酶 A 合酶与酰化醛脱氢酶串联催化甲酸转化为甲醛。通过上述设计的聚甲醛酶，将甲酸最终转化为磷酸二羟丙酮。这项工作充分证明了酶分子底物重设计能够有效引导新型代谢途径设计。

酶分子热稳定性设计

改善酶热稳定性可提高异源宿主表达量，提高温和条件下催化元件活性，并增强酶对严苛工业条件（有机溶剂、高温、极端 pH 值等）的耐受力。在蛋白质热稳定性改造方面，使用传统蛋白质进化的方法，蛋白质熔解温度的提高通常小于 15℃。而通过对蛋白质整体结构的能量计算指导的计算机设计方法则可以突破该局限，甚至可以使蛋白质的熔解温度提高超过 35℃ 以上的水平，获得具有超热稳定性的蛋白。

目前，针对酶分子热稳定性改造已发展出多种策略和算法，其预测能量与数据库值拟合程度最高相关系数（R 值）可达到 0.73（Foldx 程序）。Weiss 团队利用 SCADS 策略（Statistical, Computationally Assisted Design Strategy，SCADS）对马兜铃烯合成酶进行环境能量打分，检测氨基酸侧链与周围骨架、侧链，以及所在环境的相互作用。通过环境能量评估筛选 12 个打分最高的氨基酸进行突变，熔融温度由 38℃ 提升至 83℃。Janssen 课题组通过 FRESCO 策略（Framework for Rapid Enzyme Stabilization by Computational libraries，FRESCO）对柠檬烯环氧化物水解酶进行热稳定性突变体文库构建，通过结合 10—12 个单点突变，组合突变体的熔融温度从 50℃ 提高至 85℃，且酶的催化活性增强，半衰期延长大于 250 倍。他们还利用 FRESCO 策略对卤代烷脱卤酶（haloalkane dehalogenase）LinB 进行热稳定性计算。12 个稳定突变叠加导致 LinB 突变体熔融温度增加 23℃，并且在 60℃ 下半衰期超过 200 倍。此外，为了提高卤代醇脱卤素酶（halohydrin dehalogenase）在有机溶剂中的耐受性，Janssen 课题组利用 FRESCO 策略确定了 218 个突变点和 35 个二硫键，具有预测的稳定效应。结果显示，组合突变体（HheC-H12）熔融温度提高 28℃，对共溶剂的抗性显著增加。2016 年，Fleishman 团队开发了一种联合计算策略（protein repair one stop shop，PROSS），设计带有 51 个突变的乙酰胆碱酯酶（hAChE）突变体，通过结构分析发现该突变体可以显著改善蛋白质的核心堆积、表面极性及骨架刚性。与野生型相比，该突变体在大肠杆菌中表达水平高出 2 000 倍，热稳定性提高 20℃。

多肽的末端功能化对蛋白质生化性质具有非常重要的影响。通过对 C 端的特异性修饰可以使多肽的体内代谢半衰期延长、免疫原性降低或毒副作用减少。由于多肽结构的复杂性，化学修饰步骤多、产率低、难度很大。2016 年，中国科学院微生物研究所研究团队与荷兰格罗宁根大学以及 Enzypep 公司合作，采取一种“FRESCO 与一致性分析联合计算”策略对多肽酰胺酶进行了工程化改造，成功设计了一个经过高度改造的多肽酰胺酶突变体 PAM12A（包含 12 个突变点）。PAM12A 具有极高的热稳定性（熔解温度达到 76℃），并且可以在乙腈、丙酮等多种无水溶剂环境中保持数天的稳定活性。实验结果表明，PAM12A 可以催化包括甲酯化、羟胺化、甲胺化、胺化在内的多种不同的多肽修饰反应，且不受多肽本身序列和 C 端原功能基团的限制。