基因组的设计与工程化构建
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人工设计与合成小基因组原核细胞
Venter 研究组于 2010 年报道了人工全合成和组装 1.08 Mbp 的丝状支原体 JCVI-syn1.0 基因组，并将其移植到受体山羊支原体细胞，创造出新的细胞具有丝状支原体细胞的信息和特征。这是一个庞大的工程，参与该项目有 20 多人，历经了 15 年，花费了 4 000 万美元，从而最终完成了这一重大的人工合成基因组的任务。在全基因组合成和拼接中，需要多级的质量监控，以保证合成出来的基因组序列的精确性。例如，Venter 团队曾经因为一个碱基的错误而使得细胞不能存活——在调控染色体复制的生存必需基因 dnaA 中的一个碱基缺失造成基因的读码框移位，一个小的错误曾经耽误了他们不少的时间。这个例子表明细胞的存活是需要精确调控的。Venter 等人合成的基因组几乎跟天然的基因组一样，要理解、设计和改造生命系统，仅仅拷贝并合成一个天然的小基因组是不够的。
那么如何设计并合成一个比天然更小的基因组呢？Venter 团队从全合成的生长比较快的 1.08 Mbp 的丝状支原体 JCVI-syn1.0 基因组出发，通过多轮的设计—合成—测试，最后成功合成出了 531 kbp 且可存活的最小基因组的 JCVI-syn3.0。这个 3.0 版本比天然最小的 583 kbp 的生殖道支原体基因组更小，生长却是更快，代时仅有后者的 1/5。这被认为是接近于最小基因组的版本了。
这个成功的背后是超大量的设计、合成和测试工作。首先，他们发现基于已有知识设计最小基因组是不可行的。通过整合现有的转座子突变和敲除数据，以及分子生物学累积的知识，从 1.08 Mbp 的丝状支原体基因组 JCVI-syn1.0 中找到了可敲除的 440 个生存非必需基因，使得基因组减小到了 483 kbp。他们将这个预设的 483 kbp 的最小基因组分成 8 个大段，分别合成和测试功能。结果 8 个大段中仅 1 个大段是有功能的，但是该段的设计改造使得细菌生长很不好。导致前期的设计失败的一个重要原因是在生存必需基因（e）及非必需基因（n）之间，还存在对生长重要的准-生存必需基因。根据准-生存必需基因对生长的影响情况，他们还分了非常影响生长的基因（ie）、影响生长的基因（i），以及轻微影响生长的基因（in）。他们认为应该保留生存必需的基因 e 以及影响生长的 ie 和 i，只把基本不影响生长的 in 和 n 作为敲除的备选基因。除了准-生存必需基因之外，还存在执行生存必需功能的冗余基因。比如，基因 A 和 B 都能执行生存必需功能 E，单敲除 A 或者 B 都不影响生存必需功能 E，那么我们一般会认为 A 和 B 都是生存非必需的。但是 A 和 B 的同时缺失将导致生存必需功能 E 的缺失而使得细菌不能存活。因此，需要大量的测试工作来寻找这些准-生存必需基因，以及执行生存必需功能的冗余基因。
值得注意的是，在基因组减小的过程中，基因组大小和生长速度之间有一个平衡。随着基因组的减小，生长速度急速减慢。人工设计及合成出来的 531 kbp 支原体最小基因组 JCVI-syn3.0 代时为 180 min，比 1.08 Mbp 的支原体基因组 JCVI-syn1.0 的 60 min 的代时要慢很多。并且，它不像出发菌株那样可以在液体培养基中形成均一的混悬液，而是容易沉淀。显微镜和电镜下可以看到JCVI-syn3.0 细胞容易形成长的细丝状的网络结构，也会形成大的泡囊体。因此，这个接近于最小基因组的细胞的生长还是有缺陷的，不那么完美。但是，无论如何，这是一个成功设计与合成最小基因组的范例。