三、实验室检测操作流程

（一）病毒分离。

1.试剂配置

（1）细胞的生长液、维持液的配制见下表：

（2）粪便标本和肛拭子的处理液

完全PBS液中加入P．S溶液，终浓度为青霉素100单位/ml，链霉素为100μg/ ml。

完全PBS液的配置：取以下1份B液和1份C液加到8份A液中即为完全PBS工作液。

A液：

用600～800ml蒸馏水溶解以上盐类，加蒸馏水补至1000ml，10psi（70Kpa）15分钟高压灭菌，即为不完全PBS工作液（不含钙、镁离子）。

B液：

溶解于100ml蒸馏水中，10psi（70Kpa）15分钟高压灭菌。

C液：  

溶解于100ml蒸馏水中，10psi（70Kpa）15分钟高压灭菌。

2．病毒分离细胞系

许多细胞系可支持人肠道病毒（如EV71、CVA16）生长。

对于检测手足口病的病原来说，建议所有怀疑含EV71、CVA16等肠道病毒感染的标本均需接种到以下两种细胞系：

Ø       RD细胞，来源于人横纹肌肉瘤细胞。

Ø       HEp-2细胞，来源于人喉癌上皮细胞。

3．标本的处理

（1）粪便标本和肛拭子的处理

操作步骤：

1）在离心管上标记标本号；

2）每管中加入10ml PBS、1g玻璃珠、1ml氯仿；

3）在生物安全柜中将每一份粪便标本取大约2g加入标记好的离心管中（确保离心管上的标号与原始标本的标号一致）；肛拭子为2ml；

4）剩余的原始标本最好留在原容器中，冻存于－20℃；

5）确保拧紧离心管，用机械震荡器剧烈震荡20min；

6）在确保离心机的盖子盖好和离心桶密封的情况下，用冷冻离心机在1500g条件下离心20min；

7）在生物安全柜中将每1份标本的上清液分别吸入2个有外螺旋盖的冻存管中（如果上清液不清澈，应再用氯仿处理1次）；

8） 1管粪便悬液冻存于－20℃作为备份，另1管存于4-8℃以备接种。

（2）疱疹液标本的处理

疱疹液标本通常直接用于RNA提取或病毒分离。

（3）脑脊液标本的处理

脑脊液标本通常直接用于病毒分离。

（4）咽拭子标本的处理

咽拭子要在标本运输（保存）液中充分搅动（至少40下），以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等，用于病毒分离时，需要冻融一次（防止多次冻融），使细胞破裂，释放病毒颗粒。然后在4℃条件下，10000 rpm离心20min，用上清接种到细胞上或直接提取RNA。如果发现有细菌污染，须用滤器过滤除菌。

4．接种和观察（病毒分离）

（1）通常使用８ml的斜面试管培养细胞，传细胞时，每管加细胞培养液1.5ml。显微镜下观察单层细胞，以确保细胞是健康、无污染的。一个健康的单层细胞会在传代后48小时左右形成；

（2）倒掉生长液（GM），换上1-1.2ml的维持液（MM）；

（3）每一份标本需要同时接种2支RD细胞和2支HEp-2细胞，正确标记每支细胞培养管（包括标本的编号、日期、传代数）；

（4）每一种细胞至少标记一管作为阴性对照；

（5）每支试管接种0.2ml的标本悬液，培养温度要求36℃。

（或者使用吸附的方法接种病毒：接种标本前，倒掉生长液（GM），每支试管接种0.2ml的标本悬液，培养温度为36℃；吸附1小时后，换上1.5ml的维持液（MM）。同样每份标本需同时接种2支RD细胞和2支HEp-2细胞。

（6）使用倒置显微镜每天观察细胞培养管，以观察有特征性的肠道病毒致细胞病变效应（CPE）的出现（如细胞变圆，折光增强并脱离管壁等）；

（7）记录接种管和对照管细胞所发生的变化至少一周，记录CPE（1+—4+）、提示细胞受毒性反应、老化或污染的影响而发生的变化（1+，<25%; 2+, 25%-50%; 3+, 50%-75%; 4+, 75%-100%）；

（8）如果有特征性的肠道病毒CPE出现，要如实记录，并观察直到75%的细胞发生变化（3+ CPE），然后储藏在－20℃以备二次传代；

（9）第一代培养见可疑细胞病变时应继续传代，待细胞病变稳定出现后－20℃或－70℃冻存；

（10）一代阳性分离物再传二代，如果又有明显的CPE出现，将病毒保存在－20℃冰箱（二代病毒）。因二代病毒滴度高于一代病毒，所以选用二代病毒进行鉴定；

（11）如果7d之后没有CPE出现，那么盲传1代继续观察7d。（注意：同一病例标本的细胞培养物不能混在一起再传代，例如：不同细胞的培养物应单独传代）；

（12）盲传两代后，仍然没有出现CPE的，则判定为阴性；

（13）注意：如果接种后24h内出现CPE，很可能是标本中的非特异性成分导致的毒性反应。取100μl阳性分离物传二代，继续观察；或者在接种标本吸咐1h后用维持液清洗细胞层，可能会降低毒性反应；

（14）几个概念：

A：毒性反应：如果在接种后1-2d内细胞快速凋亡，这可能是由于标本中含有毒性物质而导致的非特异性毒性反应。这些已接种标本的试管应在-20℃冻存，融化后取0.2ml接种到同一类型细胞中（此时是第二代）。如果又出现了毒性反应，那么应该取原始标本用PBS稀释10倍，再次接种到同种细胞中。这时应被认为是第一代。

 B：微生物污染：由于细菌污染而造成培养液混浊或细胞死亡经常使病毒造成的CPE无法确定或根本无法出现。重新取原始标本，用氯仿或抗生素处理，按上述步骤重新接种到新鲜细胞上。

C：盲传：有时一周之后传代细胞会老化，甚至细胞对照也出现了病变。这时已接种标本的试管应在-20℃冻存，融化后取0.2ml接种到同一类型的新鲜单层细胞中，再观察7-10d。如果盲传两代后仍然没有产生CPE，那么认为这个标本是阴性的。

5．病毒分离结果解释

RD细胞支持HFMD的主要病原体——CVA16和EV71等多种肠道病毒的复制，CVA16和EV71均能在RD细胞培养中引起特殊的肠道病毒致细胞病变效应（CPE），表现为细胞圆缩、分散、胞浆内颗粒增加，最后细胞自管壁脱落。但相同滴度的CVA16和EV71在RD细胞中生长的速度不同，EV71的生长速度要快于CVA16，表现为EV71感染RD细胞后出现CPE的时间比CVA16早，EV71接种细胞后出现CPE很快，但CVA16一般要经过2次以上传代才出现明显的CPE。

若在使用RD细胞分离的同时再增加HEp-2细胞，可提高肠道病毒的分离率（分离出其他可能致HFMD的病原体，如一些柯萨奇B组病毒）。但CVA16和EV71在HEp-2细胞中均不繁殖。

（二）测定人双份血清标本的中和抗体滴度。

比较患者急性期血清与恢复期血清中和抗体滴度，可作为肠道病毒感染的血清学诊断方法，最常用的是中和实验，即用微量板法测定抗体滴度，是目前人肠道病毒抗体检测的最常用方法，该方法精确且具有型特异性。

作为肠道病毒感染的诊断方法之一，可以测定血清中肠道病毒中和抗体的滴度，通常用急性期血清与恢复期血清滴度进行比较，抗体滴度4倍或4倍以上增高证明病毒感染。但是，肠道病毒隐性感染也很常见，所以在评估检测结果时就要小心一些。在中和实验中，一般要用人肠道病毒参考毒株（即原型株，EV71原型株为BrCr株，CVA16原型株为G-10株）或流行株，有时同时（或单独）使用临床分离株会有助于得到更准确的检测结果。

使用对肠道病毒敏感的细胞，如RD细胞。用病毒（血清）稀释液（下面液体配制中的C液，可用维持液代替）稀释血清和制备病毒悬液，因为是用病毒来确定血清中抗体的滴度，所以要使用参考病毒（原型株），但有时使用所分离到的毒株（临床分离株）有助于得到更准确的检测结果，但分离株的滴度（100 CCID₅₀/0.05ml）要事先测定。

中和实验的检测原理：病毒感染敏感靶细胞后，引起细胞形态学变化，出现CPE，特异性中和抗体与病毒结合后，可使病毒颗粒失去感染性，抑制CPE的出现。

1．液体配制

A液：血清处理液：（100ml中含下列试剂成份）

         MEM                          85ml

         3% L-谷氨酰胺                 1ml

         7.5%碳酸氢钠                  2ml

         胎牛血清                         2ml

         青、链霉素（各10000U/ml）      10ml

    B液：细胞营养液：（按生长液配方配制，100ml中含下列试剂成份）

        MEM                          85ml

         3% L-谷氨酰胺                1ml

         7.5%碳酸氢钠                 2ml

         HEPES                          1ml

         胎牛血清                      10ml

         青、链霉素（各10000U/ml）     1ml

    C液：病毒（血清）稀释液：（按维持液配方配制，100ml中含下列液体）

         MEM                           93ml

         3% L-谷氨酰胺                 1ml

         7.5%碳酸氢钠                  2ml

         HEPES                            1ml

         胎牛血清                        2ml

         青、链霉素（各10000U/ml）        1ml

2．攻击病毒CCID₅₀滴定和滴度梯度制备

（1）将增殖后的病毒悬液冻融3次，然后在4℃、12000rpm条件下离心10min，取上清液分装于10支冻存管中，每管1.5ml，一般每管应在一次试验中用完，有剩余应高压后废弃；

（2）加Eagle液10倍系列稀释为10^-1至10^-8病毒液，各加入细胞板内，每孔50μl，每稀释度4孔细胞；

（3）每孔加细胞悬液50μl，同时设细胞对照（50μl稀释液+50μl细胞悬液）， 36℃培养7d，观察细胞病变；

（4）按Behrens-Kärber公式计算出分离病毒株的CCID₅₀；

log CCID₅₀ = L-d (S-0.5)，其中：

L = 实验中使用的最低稀释度的对数值；

d = 稀释梯度的对数值；

S = 终判时阳性部分的总和（即出现CPE的细胞孔所占的比例之和）。

（5）正式试验前应先滴定攻击病毒2-3次，取其平均值，求出每0.05ml中含100 CCID₅₀的病毒载量；

（6）按照计算好的稀释比例配制攻击病毒，求出试验所需的病毒总量（即100 CCID₅₀/0.05ml）；

（7）取3支小试管，每只加病毒稀释液（液体配制中的C液）0.9ml；

（8）用带滤芯的吸尖（ART吸尖）吸0.1ml已经稀释好的攻击病毒液（即100CCID₅₀/0.05ml）到第一支小试管中，换另一支ART吸尖，轻轻并彻底地混匀，避免产生大量气溶胶，按照此方法依次稀释至1 CCID₅₀/0.05ml和0.1 CCID₅₀/0.05ml。

3．稀释血清

（1）发病1-3d内采取患者急性期血清，发病后2-4周采取恢复期血清，分别冻存在-20℃备检。

（2）取无菌小试管若干支（每份血清使用一支）置试管架上，每管加血清处理液（上面液体配制中的A液）0.3ml，加待测血清0.1ml，盖紧塞子，震摇混匀，放4℃冰箱过夜，即为1：4稀释血清。次日56℃、30min灭活。

（3）打开独立无菌包装48孔组织培养板，纵向使用，每孔加血清稀释液（上面液体配制中的C液）0.3ml，每份血清使用一排，每排4孔。使用移液器吸取处理过的血清0.1ml加入第一孔（即为1：16），吹吸8-10次，吸0.1ml加入第二孔（即为1：64），依次至1：1024，血清稀释的过程中不必更换吸尖。即每份血清标本进行4倍倍比稀释，即1：4、1：16、1：64、1：256、1：1024。

（4）每份血清标本的每个稀释度都要平行做两孔。

4．病毒中和抗体测定的操作步骤：

（1）取一块96孔板横向使用，每块板可以做8份（4对）待测血清，版面设计如下图所示。A1-A2孔（B1-B2、C1-C2、D1-D2、E1-E2、F1-F2、G1-G2、H1-H2）中每孔加入1:1024稀释度的待测血清0.05ml，不必更换吸尖，在A3-A4孔（B3-B4、C3-C4、D3-D4、E3-E4、F3-F4、G3-G4、H3-H4）中每孔加入1:256稀释度的待测血清0.05ml，A5-A6孔（B5-B6、C5-C6、D5-D6、E5-E6、F5-F6、G5-G6、H5-H6）中每孔加入1:64稀释度的待测血清0.05ml，A7-A8孔（B7-B8、C7-C8、D7-D8、E7-E8、F7-F8、G17-G8、H7-H8）中每孔加入1:16稀释度的待测血清0.05ml，A9-A10孔（B9-B10、C9-C10、D9-D10、E9-E10、F9-F10、G9-G10、H9-H10）中每孔加入1:4稀释度的待测血清0.05ml，A11-A12孔（B11-B12、C11-C12、D11-D12、E11-E12、F11-F12、G11-G12、H11-H12）为每份待测血清对照孔，每孔中补加稀释液0.05ml；

（2）上述孔中分别加入病毒0.05ml（病毒滴度事先已经稀释为100 CCID₅₀/0.05ml）；

（3）盖好盖子后用微量板混匀器混匀，放入36℃ CO₂孵箱中孵育2h；

（4）另取一块96孔板纵向使用，做100 CCID₅₀/0.05ml病毒滴度的核实（每次实验都必须做）。每孔先加病毒稀释液（试剂配制中的C液）0.05ml，然后从0.1 CCID₅₀/0.05ml加起，每孔0.05ml，每个稀释度8孔，不必更换吸尖，一直加至100 CCID₅₀/0.05ml；同时留出4孔做为细胞对照孔，每孔加入0.1ml病毒稀释液，然后放入4℃冰箱中暂存；

（5）在孵育期间，用消化液消化细胞，准备细胞悬液，细胞悬液的浓度为2×10⁵个/ml，每块96孔板至少需要准备10ml；

（6）孵育结束后每个待测血清孔、血清对照孔（待检标本板）和病毒回滴孔和细胞对照孔（病毒回滴板）分别加入0.1ml细胞悬液，然后用微量板混匀器混匀，放入36℃ CO₂孵箱中孵育培养；

（7）使用倒置显微镜每天观察CPE，并记录病毒滴定结果，以不产生细胞病变的血清最高稀释度的倒数为终点效价。当100 CCID₅₀/0.05ml的病毒对照孔出现完全病变时，判定最终结果（约5~7d）；

（8）注意：如果病毒对照结果（病毒回滴）不在32~320 CCID₅₀/0.05ml的范围内，实验无效，就要重复实验。

5．结果判定

当最高稀释度血清的2孔中有1孔出现细胞病变，另一孔不出现细胞病变，该稀释度的倒数计即为该血清标本的中和抗体效价；当高稀释度2孔完全病变，相邻低稀释度2孔完全不病变，则两者平均稀释度的倒数即为该血清标本的中和抗体效价；当两个相邻稀释度血清均出现1孔细胞病变，另1孔不出现细胞病变，则两者平均稀释度的倒数即为该血清标本的中和抗体效价。

对于HFMD的双份血清中和实验结果来说，如果恢复期血清较急性期血清EV71或CVA16中和抗体滴度出现4倍或4倍以上增高即可确诊；如果恢复期血清较急性期血清其它肠道病毒中和抗体滴度出现4倍或4倍以上增高可证实该肠道病毒感染，是否为病因需要其它相关实验证实；如果单份血清中和抗体滴度大于1:256也有诊断意义，血清中和抗体滴度为1:128判定为可疑阳性。

（三）逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）。

1．RNA提取

可使用多种商业化试剂盒来提取RNA，针对临床标本应选择质量较高的“用于临床标本病毒RNA提取的试剂盒”，也可使用全自动RNA提取仪进行提取。针对病毒分离物，核酸提取比较容易，大部分商业化RNA提取试剂盒都可有效的提取到RNA。RNA提取依据使用的试剂不同，严格按说明书进行操作。

2．逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）

（1）引物序列合成

国家脊灰实验室自行设计3对引物，分别为人肠道病毒通用引物、EV71特异性引物和CVA16特异性引物。各省CDC依据引物序列在质量有保证的公司合成,引物合成后,需要做预实验，保证引物合成没有质量问题后,分发给地市级CDC。

1）人肠道病毒（包括EV71、CVA16）核酸检测通用引物序列：

PE2（上游）：5`- TCC GGC CCC TGA ATG CGG CTA ATC C -3`

PE1（下游）：5`- ACA CGG ACA CCC AAA GTA GTC GGT CC -3`

2）EV71核酸检测引物序列：

EV71-S（上游）：5`- GCA GCC CAA AAG AAC TTC AC -3`

EV71-A（下游）：5`- ATT TCA GCA GCT TGG AGT GC -3`

3）CVA16核酸检测引物序列：

CVA16-S（上游）：5`-ATT GGT GCT CCC ACT ACA GC-3`

CVA16-A（下游）；5`-TCA GTG TTG GCA GCT GTA GG-3`

（2）实验设计

1）在PCR记录纸（实验记录纸）上记录本次实验操作者姓名，实验日期，所鉴定标本的名称以及标本的顺序，与PCR仪排列的顺序一致。

2）标记好加标本和对照的PCR管（阳性对照，阴性对照和试剂对照）。

A：阳性对照：参比RNA，省级CDC提供（只是在初次使用，常规不建议使用，以防污染）。

B：阴性对照：使用正常细胞RNA或临床标本肠道病毒阴性的RNA（每次实验要设立）。

C：试剂对照：用去离子水代替标本（试剂初次使用时必须做）。

（3）RT-PCR扩增反应和条件

1）从临床标本或病毒中提取的RNA和各种RT-PCR试剂应该一直放在冰浴盒上；

2）配下列试剂主溶液：

10×PCR Buffer···································································5.0μl

dNTPs（2.5mM each）·······················································2.0μl

上游引物（0.1μg/μl）·························································1.0μl

下游引物（0.1μg/μl）·························································1.0μl

RNA酶抑制剂（RNasin,40U/μl）······································0.5μl

Taq DNA聚合酶（5U/μl）·················································0.5μl

AMV逆转录酶（10U/μl）··················································1.0μl

模板RNA··········································································3.0μl

RNase Free dH₂O···························································36.0μl

                         50.0μl

3）在PCR仪上进行RT-PCR反应，反应步骤如下：

42℃························45min

95℃························3min

95℃························20s

45℃························25s       ×32个循环

72℃························30s

72℃························10min

 4℃························Soak

3．电泳分析

（1）将已经聚合的3%的琼脂糖凝胶放在电泳装置上；

（2）在帕拉膜（Parafilm）上加上6 × 电泳载样缓冲液（每个反应需1μl）。再加上5μl的PCR反应产物与之混合；

（3）将电泳缓冲液倒在电泳装置中，用吸尖将样品与载样缓冲液的混合溶液加到孔中；

（4）盖上盖子，接通电源，以10V/cm电压（恒定电压）电泳，大约35-40min，直到溴酚蓝跑到凝胶的底部的时候，停止电泳；

（5）将胶取出，并注意保持凝胶的方向；

（6）在1μg/ml的溴化乙锭溶液中染色15min，

注意：溴化乙锭溶液是有毒、致畸、并且致肿瘤的物质，操作时要加小心，并戴双层手套。如果储存在避光的容器中，溴化乙锭溶液可以重复使用。溴化乙锭废弃物按医疗废弃物中化学品的有关规定处理。

（7）在蒸馏水中涮一下凝胶；

（8）在紫外透射仪下观察PCR产物电泳结果，并照相作记录。

有条件的实验室可以使用全自动电泳分析仪。

4．结果解释

使用全自动电泳分析仪的实验室可以通过仪器自动读取PCR产物大小，来判断结果。通过琼脂糖凝胶做PCR产物电泳的实验室，需要参照DNA分子量对照对照，比较标本的PCR产物与阳性对照的PCR产物在凝胶上的位置以及大小来解释结果。

RT-PCR实验结果解释表

(四) Real-time RT-PCR （rRT-PCR）

1. 病毒核酸提取

参考常规RT-PCR病毒核酸提取步骤和注意事项。

2. Real-time RT-PCR （rRT-PCR）

依据不同厂家的试剂盒，严格按相应说明书操作和判断结果。有5种试剂盒，分别为One Step Real-time PCR法检测EV71病毒核酸（单通道检测）；One Step Real-time PCR法检测CVA16核酸（单通道检测）；One Step Real-time PCR法检测肠道病毒核酸（单通道检测）；One Step Real-time PCR法同时检测EV71和CVA16核酸（双通道检测）；One Step Real-time PCR法同时检测EV71和肠道病毒核酸（双通道检测）。下面举2个例子来说明单通道检测和双通道检测的操作规程和注意事项。

（1） One Step Real-time PCR法检测EV71病毒核酸（单通道检测）

①反应体系配置：反应体系共25μl，模板量可根据样本情况自行决定（临床标本通常使用5μl的RNA模板量），不够部分以水补足。如选用另外试剂盒，反应体系及条件随之变化。

a.从试剂盒中取出相应的试剂，反应液在室温融化后，瞬时离心，按n+1配置反应体系（n=样本数+1管阳性对照+1管阴性对照），每个测量反应体系配置如下表：

b.将上述反应液混匀离心后，按照每管20μL分装于各荧光PCR仪适用的PCR管中。

c.加样：将提取好的样本RNA，分别加入上述分装好的PCR反应管中，模板量可根据样本情况自行决定（临床标本通常使用5ul模板量），不够部分以水补足。总反应体积25μL。

②荧光RT-PCR循环条件设置

③对照设置

阴性对照：核酸提取时以灭菌双蒸水代替标本，每次实验应设立。

阳性对照：由省级实验室提供EV71阳性核酸（只在评价试剂时使用）

④结果分析条件设定和结果判断

阈值设定

原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点，结果显示阴性为准，或可根据仪器噪音情况进行调整。

Ct值≤35.0的样本为阳性。

38.0> Ct值>35.0的样本为临界值。

Ct值≥38.0的样本或无数值的标本为阴性。

（2） One Step Real-time PCR法同时检测EV71和CVA16核酸（双通道检测）

双通道可以同时检测EV71和CVA16核酸,在提取核酸后短时间(2.5小时)内检测到标本中是否含EV71或CVA16核酸。

①反应体系配置

反应体系共25μl，模板量可根据样本情况自行决定（临床标本通常使用5μl模板量），不够部分以水补足。如选用另外试剂盒，反应体系及条件随之变化。

a.先将试剂解冻，从试剂盒中取出相应的试剂，反应液在室温融化后，瞬时离心，按n+1配置25μl反应体系（n=样本数+1管阳性对照+1管阴性对照），每个测量反应体系配置如下表：

b.将下述反应液混匀离心后，按照每管20μL分装于适用的PCR管中。

c.加样：将提取好的样本RNA，分别加入上述分装好的PCR反应管中，模板量可根据样本情况自行决定（临床标本通常使用5ul模板量），不够部分以水补足。总反应体积25μL。

②荧光RT-PCR循环条件设置

③结果分析条件设定和结果判断

阴性对照：核酸提取时以灭菌双蒸水代替标本。

阳性对照：提取好的阳性核酸作为模板RNA。

阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点，结果显示阴性为准，或可根据仪器噪音情况进行调整。

Ct值≤35.0的样本为阳性。

Ct值无数值的标本和Ct值≥38.0的样本为阴性样本。

38.0> Ct值>35.0的样本为临界值。

注：荧光PCR同时读取FAM和HEX，进行双通道检测，FAM荧光Ct值为CVA16的结果，HEX荧光 Ct值为EV71的结果。